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Englische Version Site map FAIR 3889 Viren Phytoplasmen Pathogensammlung Pathogennachweis ACLSV ApMV ASGV ASPV PPV PDV PNRSV ArMV ToRSV RpRSV SLRSV GFLV GLRaV-1 GLRaV-3 LChV CMLV CRMV CNRMV CGRMV ChTLV CVA AP ESFY PD Pathogeneliminierung Kontakt Nützliche Links

Pathogennachweis Zum Nachweis von Pathogenen stehen verschiedene Methoden zur Verfügung. Die Methodenwahl hängt vom nachzuweisenden Pathogen, der erwünschten Schnelligkeit, vorhandenen Ausrüstung und dem finanziellen Rahmen ab. Alle diese Aspekte sollten Berücksichtigung finden, wenn ein Testsystem für kommerziell gehandeltes Vermehrungsmaterial ausgewählt wird. International zugelassene Nachweissysteme schließen serologische und molekulare Labormethoden sowie Indexierung im Glashaus und Freiland ein. Sie werden von der Arbeitsgruppe für Obstvirosen der ISHS geprüft und im Rahmen regelmäßiger Treffen (Wien 1991 (Acta Hort. 309: 407-418, 1992), Bethesda 1997 (Acta Hort. 472: 761-783, 1998), Canterbury 2000) auf neuestem Stand gehalten. Eine Übersicht dieser Methoden für Kernobst und Steinobst findet sich in Tabellenform am Ende dieser Seite. Viren Viren können durch Indexing im Freiland und Glashaus, durch serologische Methoden, bildgebende Verfahren wie beispielsweise Elektronenmikroskopie, molekulare Hybridisierung, Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) und PCR nachgewiesen werden. Die ISHS ´Working Group on Virus Diseases of Fruit Trees´ empfiehlt serologisches Indexing (ELISA) seit vielen Jahren. Seit der Konferenz von Bethesda im Jahre 1997 werden vor allem Anstrengungen unternommen, Testsysteme auf der Basis der PCR zu entwickeln, die sich durch hohe Sensitivität und Geschwindigkeit auszeichnen. Im Rahmen des Projekts FAIR 3889 wurden sowohl für RNA-Präparation wie auch für breitbandigen und spezifischen Nachweis von Obstvirosen verbesserte Verfahren entwickelt. Zum Seitenanfang Phytoplasmen Da Phytoplasmen charakteristische morphologische Anomalien verursachen, können sie durch genaue Inspektion von Obstanlagen und Baumschulen erkannt werden. Zudem ist ein zuverlässiger Nachweis von ESFY durch Indexing auf GF 305-Unterlagen im Glashaus möglich, wobei Inkubationszeiten von 4 Monaten abzuwarten sind. In den Siebröhren von Blattstielen, Borke und Wurzeln können Phytoplasmen durch DAPI-Färbung sichtbar gemacht werden. Der Nachweis mittels PCR als rasches und zuverlässiges Diagnoseverfahren wurde im Rahmen des Projekts FAIR 3889 optimiert. Die Verlässlichkeit dieses Nachweisverfahrens hängt entscheidend von der Qualität der eingesetzten DNA ab. Aus diesem Grunde wurden verschiedene Protokolle zur DNA-Reinigung untersucht. Durch die Verfahren der Plate Capture PCR und der IC-PCR kann zudem der initiale Reinigungsschritt durch die Verwendung von Antisera entscheident vereinfacht werden. Zum Seitenanfang Indexierung Indexierung basiert auf der Fähigkeit bestimmter Indikatorpflanzen, nach Infektion mit einem Virus typische Krankheitsmerkmale zu entwickeln. Die zu testende Sorte wird auf die Indiktorpflanze veredelt oder es wird eine mechanische Übertragung von Pflanzensaft durchgeführt. Nach einer festgelegten Inkubationszeit werden die Indikatorpflanzen auf das Vorhandensein von sichtbaren Symptomen untersucht. Die folgende Tabelle gibt eine Übersicht emfohlener Indexierungsverfahren, der verwendeten Indikatorpflanzen sowie der Viren, die nachgewiesen werden können. Weitere Informationen zum Thema Indexing finden sie auf der Homepage der Washington State University. Typ Indikator Zeitaufwand Nachweisbare Viren Glashausindexierung mit krautigen Indikatoren Chenopodium quinoa 20 Tage ACLSV, ASGV, Nepoviren Cucumis sativus 20 Tage ApMV, PDV, PNRSV Glashausindexierung mit holzigen Indikatoren Malus platycarpa 8 Wochen ACLSV Malus pumila ´Virginia Crab´ 24 Wochen ASGV, ASPV Malus pumila R 12740 7A 4 Wochen ACLSV Malus pumila spy 227 12 Wochen ASPV Cydonia oblonga C 7/1 5 Wochen ACLSV Prunus persica GF 305 8 Wochen ACLSV, PPV, PDV, PNRSV, SLRSV, ESFY Prunus tomentosa 12 Wochen ACLSV, PPV, PDV, PNRSV Prunus serrulata ´Shirofugen´ 8 Wochen PDV, PNRSV Freilandindexierung Malus platycarpa 2 Jahre ACLSV Pyronia veitchii 2 Jahre ASPV Malus pumila ´Virginia crab´ 3 Jahre ASGV, ASPV Malus pumila R 12740 7A 2 Jahre ACLSV Malus pumila spy 227 2 Jahre ASPV Malus pumila ´Lord Lambourne´ 3 Jahre ApMV, rubbery wood, flat limb, chat fruit Malus pumila ´Gravensteiner´ 3 Jahre flat limb Malus pumila ´Golden Delicious´ 2 Jahre ApMV, AP Prunus serrulata ´Shirofugen´ 6 Wochen - 2 Jahre PDV, PNRSV Prunus serrulata ´Kwanzan´ 2 Jahre CGRMV Prunus avium ´Bing´ 3 Jahre CRLV, CTLV, SLRSV, ArMV, CNRSM, CRMV Prunus avium ´Sam´ 3 Jahre LChV Prunus avium Canindex I 3 Jahre CNRMV Prunus persica GF 305 4 Jahre ACLSV, PPV, PDV, PNRSV, ESFY Zum Seitenanfang Serologische Methoden Der ELISA-Test (Enzyme Linked Immunosorbant Assay) wurde bereits vor über 30 Jahren zum Nachweis von Pflanzenviren entwickelt. Er wird routinemässig zur Massenuntersuchung von Pflanzen eingesetzt, ist rasch, kostengünstig und einfach durchzuführen. Allerdings kann er nur für Pathogene eingesetzt werden, von denen Antiseren im Handel erhältlich sind. Die Einsetzbarkeit wird weiters durch die ungleiche Verteilung mancher Pathogene in der Pflanze sowie durch klimatische Einflüsse, die den Virustiter unter die Nachweisgrenze drücken können, eingeschränkt. Nach der Anwendung von Verfahren zur Viruseliminierung muss berücksichtigt werden, dass es Monate dauern kann, bis eventuell verbliebene Viren wieder einen mittels ELISA nachweisbaren Titer aufgebaut haben. Die Methode des Immuno-Tissue-Printing ermöglicht die Erfassung der Virusverteilung im Pflanzengewebe und kann damit zur Verbesserung von in vitro Eliminierungsverfahren beitragen. Zum Seitenanfang Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Mit der Polymerase-Kettenreaktion können spezifische DNA-Abschnitte so stark vermehrt werden, dass ihr Nachweis anschliessend leicht möglich ist. Diese DNA wird üblicherweise durch Gel-Elektrophorese sichtbar gemacht. Im Pathogennachweis hat sich die PCR um einen Faktor 100 bis 1000 sensitiver als der ELISA-Test erwiesen. Daher ist sie besonders für den Nachweis geringer Virenkonzentrationen, wie sie vor allem bei frischen Infektionen auftreten, von Nutzen. Zahlreiche Seiten im World Wide Web beschäftigen sich mit der PCR. Die folgenden Links geben einen kurzen technischen Überblick über diese Methode: "What the heck is PCR" von C. Brown "Principle of PCR" von Andy Vierstraete Kurze Beschreibung der PCR von der University of Califormia Detaillierte PCR-Protokolle vom University College in London Die DNA von Phytoplasmen kann direkt in der PCR eingesetzt werden. Die meisten Pflanzenviren enthalten hingegen RNA als Erbsubstanz. Für deren Nachweis ist es erforderlich, diese RNA erst zu reinigen und dann mit Hilfe eines Enzyms (RT, reverse Transkriptase) in DNA zu übersetzen, die dann mittels PCR vermehrt werden kann. Zum Pathogennachweis werden verschiedene Primer-Paare verwendet. Dabei handelt es sich um kurze Fragmente aus der Erbsubstanz des Pathogens, die die vermehrten Abschnitte flankieren. Im Rahmen des Projekts FAIR 3889 wurden Primerpaare für verschiedene bedeutende Obstvirosen entwickelt. Die PCR-Produkte können durch enzymatischen Verdau weiter untersucht werden. Dadurch erhält man ´Fingerabdrücke´, die einerseits den Virusnachweis zusätzlich absichern, andererseits verwendet werden können, um Untergruppen bestimmter Viren zu identifizieren. Zum Seitenanfang Serologische und molekulare Labormethoden zum Nachweis von Viren und Phytoplasmen in Kernobst Pathogen (für Details anklicken) Serologische Tests Molekulare Tests Literatur ACLSV ELISA RT-PCR IC-RT-PCR RT-PCR ELOSA 6, 27, 30, 31, 41 ASGV ELISA RT-PCR IC-RT-PCR RT-PCR ELOSA 9, 27, 29, 30, 31, 37, 39 ASPV   RT-PCR NASBA 25, 29, 30, 31, 38, 40, 58 ApMV ELISA RT-PCR IC-RT-PCR RT-PCR ELISA 5, 56 ToRSV ELISA RT-PCR RT-PCR ELISA Hybridization 18, 19, 43, 56 AP ELISA PCR IC-PCR 8, 21, 35, 36, 59 PD   PCR 8, 10, 12, 35, 36, 59 Zum Seitenanfang Serologische und molekulare Labormethoden zum Nachweis von Viren und Phytoplasmen in Steinobst Pathogen (für Details anklicken) Serologische Tests Molekulare Tests Referenz ACLSV ELISA RT-PCR IC-RT-PCR 6, 27, 30, 31, 41 ApMV ELISA RT-PCR IC-RT-PCR RT-PCR ELISA 5, 56 PPV ELISA RT-PCR IC-RT-PCR   PDV ELISA RT-PCR IC-RT-PCR 42 PNRSV ELISA RT-PCR RT-PCR ELISA 5, 20, 60 ToRSV ELISA RT-PCR RT-PCR ELISA Hybridization 18, 19, 43, 56 ArMV ELISA RT-PCR Hybridization NASBA 19, 37 RpRSV ELISA NASBA   SLRSV ELISA NASBA   LChV   RT-PCR 26, 28, 46, 49, 50, 53, 62 CMLV ELISA     CRLV ELISA     CVA   RT-PCR IC-RT-PCR 22 TRSV ELISA     TBRV ELISA     ESFY   PCR 1, 8, 11, 13, 21, 23, 32, 35, 59 Zum Seitenanfang Literatur Ahrens U., Lorenz K. 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